生命科學

狂犬病毒改邪歸正

神經科學家利用基因工程技術改造狂犬病病毒,讓它來繪製精準的神經迴路。

撰文/馬瑞(Andrew J. Murray)
翻譯/林雅玲

生命科學

狂犬病毒改邪歸正

神經科學家利用基因工程技術改造狂犬病病毒,讓它來繪製精準的神經迴路。

撰文/馬瑞(Andrew J. Murray)
翻譯/林雅玲


月夜下的英國沼地,《巴斯克維爾的獵犬》小說如此描述三位虛構的狂歡者對於眼前可怕景象感到的震驚:「有隻邪惡的怪物,龐大的黑色野獸,形狀像獵犬,比任何人看過的獵犬還要大。他們目睹那個怪物扯斷巴斯克維爾(Hugo Baskerville)的喉嚨,牠熾熱的眼睛接著轉向他們,並對著他們流口水,三人因恐懼而尖叫,為了活命而狂奔。」


偵探小說家柯南.道爾(Arthur Conan Doyle)在《巴斯克維爾的獵犬》描寫讓讀者感到恐怖的情景,醫學史學家分析後,認為是源自狂犬病對當代英國社會的深刻影響。狂犬病毒讓乖巧的寵物轉變成流著口水的殘虐野獸,加上近100%的死亡率,成為人類歷史上最令人恐懼的疾病之一。早在1804年,德國醫師辛克(Georg Gottfried Zinke)的實驗指出,感染狂犬病的動物唾液含有高濃度的病毒。這種病毒會增強唾液產生,進而增加口腔裡的病毒含量,這也是染病犬隻流口水的原因。1880年代法國科學家巴斯德(Louis Pasteur)證實,受感染動物的腦中也充滿病毒。這些觀察都事出有因。兩個世紀以來的研究已確認,狂犬病毒會讓受感染的動物從口水狂流的狀態,轉換成瘋狂噬咬。病毒透過演化操縱宿主的大腦,確保自身有效傳播。


狂犬病每年造成5萬9000多人死亡。因為接種疫苗和隔離策略,狂犬病不再引起已開發國家的恐慌。相反地,神經科學家正試圖駕馭狂犬病毒,使其成為有助於人類研究的工具。狂犬病毒擅長在神經元間悄悄移動,避開免疫系統的偵察,從傷口部位進入大腦。許多研究人員已經掌握並改造狂犬病毒的能力,藉此了解神經元如何彼此聯繫。


人類大腦由數十億個神經元組成,每個神經元都與數千個神經元相連,想了解人類的感受和行為,需要解開腦中錯綜複雜的神經迴路。科學家利用基因改造的狂犬病毒,已經可以觀察到特定類型的神經元會接收哪些種類的訊號、電脈衝怎麼從眼睛傳遞至大腦,以及是哪些神經元類型能協助我們控制肢體動作而避免跌倒。儘管這個領域才剛起步,但有朝一日這些研究成果有助於進一步了解帕金森氏症等神經退化疾病,甚至開發嶄新療法。


首先,帶原動物的撕咬過程,會把病毒顆粒注入對方的肌肉組織。狂犬病毒長得像是子彈膠囊,裡面裝有單股RNA和蛋白質,外殼則包覆了棘狀突起的醣蛋白。這個醣蛋白外殼會欺騙運動神經元,被咬傷部位的神經元末端把病毒帶進體內,運動神經元會釋出導致肌肉收縮的化學物質,這些神經元一顆顆接力把病毒傳遞直至傷者大腦,也就是病毒最終的目的地。


從傷口到大腦


確切地說,醣蛋白會與運動神經元突觸末梢的受體結合,並把訊號傳遞給相鄰神經元。就像經由機場安檢區出境一樣,突觸末梢負責守衛神經元間突觸的單向交流。一般而言,突觸的「下游方向」是指從大腦到肌肉的訊號在神經元間傳遞。然而,狂犬病毒卻是朝上游傳播,因為它必須進入大腦,因此它欺騙運動神經元的受體,從原本的出口進入身體。病毒擅長利用宿主細胞達到目的,狂犬病毒尤其是箇中高手。


入侵病毒一旦進入細胞,便會拋棄醣蛋白外殼的偽裝、病毒RNA便開始運作,利用細胞裡的物質和代謝程序來製造更多病毒RNA以及自己所需的蛋白質,這些病毒的組成成份接著會組裝成更多病毒。許多種類的病毒複製速度快到迫使受感染的細胞爆裂,讓病毒顆粒釋出到細胞間隙,狂犬病毒則嚴格控管自身繁殖速度,只會產生足以繼續朝向下顆神經元前進的後代。


如此一來,病毒能避免對宿主身體造成過大的傷害,不會驚動免疫系統。有別於其他種病毒,狂犬病毒維持宿主細胞的完整性,接著跨越突觸前進到上游未受感染的神經元。這種無聲無息的感染方式也是狂犬病擁有長時間無症狀潛伏期的原因,在人類身上通常潛伏1~3個月。


一旦跳躍到另一顆神經元,病毒會再次啟動整個流程:脫掉外殼、製造並組裝更多病毒,繼續往上游神經元前進。透過這種方式,狂犬病毒找到一條穿越神經系統的途徑,從最初在肌肉組織中遇到的運動神經元,步步逼近脊髓與大腦。


21世紀初期,幾個研究團隊開始利用狂犬病毒做為追蹤神經元迴路的工具,包括現任職法國薩克雷神經科學研究所的神經生物學家烏戈利尼(Gabriella Ugolini)和現任職美國匹茲堡大學的神經生物學家斯特瑞克(Peter Strick)。然而,要解開病毒從肌肉到大腦的途徑,仍是一大挑戰。當神經科學家檢視受病毒感染的神經元影像時,如何區分哪些神經元是病毒第一次跳躍的受害者,哪些又是第二次和後續感染?


研究人員一開始的解決辦法,是在實驗動物感染後不久便犧牲牠們,讓病毒僅跨越1~2個突觸。這種策略揭露了大腦中參與運動控制的幾條主要途徑,不過這個方法也有缺點。兩顆神經元間的連接並非相當,有的突觸可能比較強或比較弱,因此在其間傳遞的訊號可能更多或更少,促使目標神經元產生電脈衝的能力便有差異。有的突觸靠近細胞本體,有的位於神經元突出的末端。此外,有些神經元與下游神經元僅有單一連接,但是也有一些神經元與下游神經元產生數百個連接。這種異質性,代表著病毒從一顆神經元傳播到另一顆神經元所需的時間也有差異,因此提高了不確定性。如果病毒在跨越弱突觸前先跨越了兩個或三個強突觸,會有怎樣的結果呢?


讓目標神經元閃閃發亮


為了解決這個問題,科學家需要改造狂犬病毒。分子生物學家開發出操縱DNA的驚人技術,搬動基因已是他們的日常工作,就像在實驗室裡泡杯咖啡一樣。不過野生型狂犬病毒只擁有RNA,不像DNA可以方便操縱。反向遺傳學(reverse gemetics)讓科學家跨越這個障礙,該技術翻轉了常規的遺傳循環定律:根據DNA製造RNA。


1994年,德國聯邦動物病毒病研究中心的病毒學家施內爾(Matthias Schnell)和孔哲曼(Karl-Klaus Conzelmann)在實驗室僅利用病毒的DNA複製體就能製造出具有功能的狂犬病毒,甚至改變了攜帶狂犬病毒特徵編碼RNA的基因組。科學家能迅速操縱基因組後,更加了解狂犬病毒的不同基因如何賦予病毒多樣技能。事實證明,病毒只需一個醣蛋白的基因,便能在神經元間移動。基因組被剔除了醣蛋白基因的狂犬病毒,仍可感染細胞,但是進入細胞後就會受困在裡面,這項發現把病毒學帶向主流神經科學。


2007年,美國沙克生物研究院的神經科學家維克沙姆(Ian Wickersham)、系統神經生物學家卡拉威(Edward Callaway)與孔哲曼以及德國弗里德里希-勒夫勒研究所的病毒學家芬克(Stefan Finke)合作研究,開發出一個繪製神經元迴路的巧妙系統。他們合作計畫的第一步,是以螢光蛋白基因取代狂犬病毒基因組裡的醣蛋白基因。基改病毒無法製造醣蛋白,而是隨著其他狂犬病毒製造蛋白質時產生許多螢光蛋白,因此受感染細胞會呈現出研究人員選擇的顏色而閃閃發亮。


計畫第二步是透過另一種基因改造技術,讓研究人員感興趣的神經元提供病毒醣蛋白。如此一來,神經元裡的病毒可穿上醣蛋白外殼進行一次跳躍,接著便會受困在那顆神經元裡。為了達成這個任務,科學家利用了單純的腺相關病毒(AAV,其基因組僅含有少量的DNA,這種病毒經常與體型更大的腺病毒一起出現),沙克生物研究院的研究人員把狂犬病毒的醣蛋白基因放進腺相關病毒的基因組裡,讓狂犬病毒可利用該基因製造的醣蛋白,跨越一個突觸。......