生命科學

狂犬病毒改邪歸正

神經科學家利用基因工程技術改造狂犬病病毒,讓它來繪製精準的神經迴路。

撰文/馬瑞(Andrew J. Murray)
翻譯/林雅玲

生命科學

狂犬病毒改邪歸正

神經科學家利用基因工程技術改造狂犬病病毒,讓它來繪製精準的神經迴路。

撰文/馬瑞(Andrew J. Murray)
翻譯/林雅玲


月夜下的英國沼地,《巴斯克維爾的獵犬》小說如此描述三位虛構的狂歡者對於眼前可怕景象感到的震驚:「有隻邪惡的怪物,龐大的黑色野獸,形狀像獵犬,比任何人看過的獵犬還要大。他們目睹那個怪物扯斷巴斯克維爾(Hugo Baskerville)的喉嚨,牠熾熱的眼睛接著轉向他們,並對著他們流口水,三人因恐懼而尖叫,為了活命而狂奔。」


偵探小說家柯南.道爾(Arthur Conan Doyle)在《巴斯克維爾的獵犬》描寫讓讀者感到恐怖的情景,醫學史學家分析後,認為是源自狂犬病對當代英國社會的深刻影響。狂犬病毒讓乖巧的寵物轉變成流著口水的殘虐野獸,加上近100%的死亡率,成為人類歷史上最令人恐懼的疾病之一。早在1804年,德國醫師辛克(Georg Gottfried Zinke)的實驗指出,感染狂犬病的動物唾液含有高濃度的病毒。這種病毒會增強唾液產生,進而增加口腔裡的病毒含量,這也是染病犬隻流口水的原因。1880年代法國科學家巴斯德(Louis Pasteur)證實,受感染動物的腦中也充滿病毒。這些觀察都事出有因。兩個世紀以來的研究已確認,狂犬病毒會讓受感染的動物從口水狂流的狀態,轉換成瘋狂噬咬。病毒透過演化操縱宿主的大腦,確保自身有效傳播。


狂犬病每年造成5萬9000多人死亡。因為接種疫苗和隔離策略,狂犬病不再引起已開發國家的恐慌。相反地,神經科學家正試圖駕馭狂犬病毒,使其成為有助於人類研究的工具。狂犬病毒擅長在神經元間悄悄移動,避開免疫系統的偵察,從傷口部位進入大腦。許多研究人員已經掌握並改造狂犬病毒的能力,藉此了解神經元如何彼此聯繫。


人類大腦由數十億個神經元組成,每個神經元都與數千個神經元相連,想了解人類的感受和行為,需要解開腦中錯綜複雜的神經迴路。科學家利用基因改造的狂犬病毒,已經可以觀察到特定類型的神經元會接收哪些種類的訊號、電脈衝怎麼從眼睛傳遞至大腦,以及是哪些神經元類型能協助我們控制肢體動作而避免跌倒。儘管這個領域才剛起步,但有朝一日這些研究成果有助於進一步了解帕金森氏症等神經退化疾病,甚至開發嶄新療法。


首先,帶原動物的撕咬過程,會把病毒顆粒注入對方的肌肉組織。狂犬病毒長得像是子彈膠囊,裡面裝有單股RNA和蛋白質,外殼則包覆了棘狀突起的醣蛋白。這個醣蛋白外殼會欺騙運動神經元,被咬傷部位的神經元末端把病毒帶進體內,運動神經元會釋出導致肌肉收縮的化學物質,這些神經元一顆顆接力把病毒傳遞直至傷者大腦,也就是病毒最終的目的地。


從傷口到大腦


確切地說,醣蛋白會與運動神經元突觸末梢的受體結合,並把訊號傳遞給相鄰神經元。就像經由機場安檢區出境一樣,突觸末梢負責守衛神經元間突觸的單向交流。一般而言,突觸的「下游方向」是指從大腦到肌肉的訊號在神經元間傳遞。然而,狂犬病毒卻是朝上游傳播,因為它必須進入大腦,因此它欺騙運動神經元的受體,從原本的出口進入身體。病毒擅長利用宿主細胞達到目的,狂犬病毒尤其是箇中高手。


入侵病毒一旦進入細胞,便會拋棄醣蛋白外殼的偽裝、病毒RNA便開始運作,利用細胞裡的物質和代謝程序來製造更多病毒RNA以及自己所需的蛋白質,這些病毒的組成成份接著會組裝成更多病毒。許多種類的病毒複製速度快到迫使受感染的細胞爆裂,讓病毒顆粒釋出到細胞間隙,狂犬病毒則嚴格控管自身繁殖速度,只會產生足以繼續朝向下顆神經元前進的後代。


如此一來,病毒能避免對宿主身體造成過大的傷害,不會驚動免疫系統。有別於其他種病毒,狂犬病毒維持宿主細胞的完整性,接著跨越突觸前進到上游未受感染的神經元。這種無聲無息的感染方式也是狂犬病擁有長時間無症狀潛伏期的原因,在人類身上通常潛伏1~3個月。


一旦跳躍到另一顆神經元,病毒會再次啟動整個流程:脫掉外殼、製造並組裝更多病毒,繼續往上游神經元前進。透過這種方式,狂犬病毒找到一條穿越神經系統的途徑,從最初在肌肉組織中遇到的運動神經元,步步逼近脊髓與大腦。


21世紀初期,幾個研究團隊開始利用狂犬病毒做為追蹤神經元迴路的工具,包括現任職法國薩克雷神經科學研究所的神經生物學家烏戈利尼(Gabriella Ugolini)和現任職美國匹茲堡大學的神經生物學家斯特瑞克(Peter Strick)。然而,要解開病毒從肌肉到大腦的途徑,仍是一大挑戰。當神經科學家檢視受病毒感染的神經元影像時,如何區分哪些神經元是病毒第一次跳躍的受害者,哪些又是第二次和後續感染?


研究人員一開始的解決辦法,是在實驗動物感染後不久便犧牲牠們,讓病毒僅跨越1~2個突觸。這種策略揭露了大腦中參與運動控制的幾條主要途徑,不過這個方法也有缺點。兩顆神經元間的連接並非相當,有的突觸可能比較強或比較弱,因此在其間傳遞的訊號可能更多或更少,促使目標神經元產生電脈衝的能力便有差異。有的突觸靠近細胞本體,有的位於神經元突出的末端。此外,有些神經元與下游神經元僅有單一連接,但是也有一些神經元與下游神經元產生數百個連接。這種異質性,代表著病毒從一顆神經元傳播到另一顆神經元所需的時間也有差異,因此提高了不確定性。如果病毒在跨越弱突觸前先跨越了兩個或三個強突觸,會有怎樣的結果呢?


讓目標神經元閃閃發亮


為了解決這個問題,科學家需要改造狂犬病毒。分子生物學家開發出操縱DNA的驚人技術,搬動基因已是他們的日常工作,就像在實驗室裡泡杯咖啡一樣。不過野生型狂犬病毒只擁有RNA,不像DNA可以方便操縱。反向遺傳學(reverse gemetics)讓科學家跨越這個障礙,該技術翻轉了常規的遺傳循環定律:根據DNA製造RNA。


1994年,德國聯邦動物病毒病研究中心的病毒學家施內爾(Matthias Schnell)和孔哲曼(Karl-Klaus Conzelmann)在實驗室僅利用病毒的DNA複製體就能製造出具有功能的狂犬病毒,甚至改變了攜帶狂犬病毒特徵編碼RNA的基因組。科學家能迅速操縱基因組後,更加了解狂犬病毒的不同基因如何賦予病毒多樣技能。事實證明,病毒只需一個醣蛋白的基因,便能在神經元間移動。基因組被剔除了醣蛋白基因的狂犬病毒,仍可感染細胞,但是進入細胞後就會受困在裡面,這項發現把病毒學帶向主流神經科學。


2007年,美國沙克生物研究院的神經科學家維克沙姆(Ian Wickersham)、系統神經生物學家卡拉威(Edward Callaway)與孔哲曼以及德國弗里德里希-勒夫勒研究所的病毒學家芬克(Stefan Finke)合作研究,開發出一個繪製神經元迴路的巧妙系統。他們合作計畫的第一步,是以螢光蛋白基因取代狂犬病毒基因組裡的醣蛋白基因。基改病毒無法製造醣蛋白,而是隨著其他狂犬病毒製造蛋白質時產生許多螢光蛋白,因此受感染細胞會呈現出研究人員選擇的顏色而閃閃發亮。


計畫第二步是透過另一種基因改造技術,讓研究人員感興趣的神經元提供病毒醣蛋白。如此一來,神經元裡的病毒可穿上醣蛋白外殼進行一次跳躍,接著便會受困在那顆神經元裡。為了達成這個任務,科學家利用了單純的腺相關病毒(AAV,其基因組僅含有少量的DNA,這種病毒經常與體型更大的腺病毒一起出現),沙克生物研究院的研究人員把狂犬病毒的醣蛋白基因放進腺相關病毒的基因組裡,讓狂犬病毒可利用該基因製造的醣蛋白,跨越一個突觸。


然而,狂犬病毒沒辦法帶走醣蛋白基因,因為醣蛋白基因是由DNA構成,而非RNA。因此,當病毒跳進另一顆神經元,就會再次被困住。此時,研究人員只要檢查受感染動物的大腦,找出神經系統中發光的細胞群,就能得知目標神經元與哪顆神經元相連。


基改病毒跳跳跳


不過,研究還是遇到問題。注射狂犬病毒到實驗動物大腦中,會直接感染那些向注射處長出突起末端的神經元。如果一開始不限制狂犬病毒只感染特定神經元,就很難分辨哪些神經元是受到注射病毒直接感染,哪些是病毒穿過一個突觸後才受到感染。解決方案來自病毒學另一個領域:專一感染鳥類的病毒。


野外中存在許多種類的病毒,不同病毒能感染的動物類型也不一樣。舉例來說,鳥類白血病性肉瘤性病毒(ASLV)通常會造成雞隻罹患癌症,但這種病毒往往無法感染哺乳動物。ASLV也如同狂犬病毒,具有醣蛋白構成的外殼,醣蛋白之間則有不同的樣式。ASLV的醣蛋白被命名為Env,區別不同醣蛋白的方式是在Env後面加上特定的標記。每種醣蛋白亞型都會與特定受體結合。舉例來說,醣蛋白EnvA會與TVA受體結合,如果細胞沒有TVA受體,就不會受到包覆EnvA的病毒的感染。研究人員利用這種選擇性的結合,限制狂犬病毒一開始僅能感染某一類神經元。


維克沙姆、卡拉威及同事在狂犬病毒感染的培養細胞裡加入鳥類病毒的EnvA醣蛋白基因,以EnvA醣蛋白取代狂犬病毒原本的醣蛋白外殼,這個過程稱為假型化(pseudotyping)。如此一來,狂犬病毒就沒辦法誘騙哺乳動物細胞讓其進入。接著,研究人員再讓小鼠腦中的目標神經元帶有TVA受體,就能確保狂犬病毒僅會感染這些細胞。


此外,研究人員也供應目標神經元(實際上是某一類型神經元)帶有狂犬病毒醣蛋白基因的腺相關病毒。一旦進入目標神經元,狂犬病毒會脫掉鳥類病毒外殼、穿上正常外殼,並跳向上游神經元。研究人員讓基因改造的狂犬病毒只感染明確類型的「起始」神經元並且只能進行一次跳躍,便可清楚解開大腦神經元連接的方式。


微調病毒株


由此可知,狂犬病毒系統相當簡單且優雅,在神經科學界引起旋風(這個系統的發明者將之命名為delta-G)。有了它,研究人員就能檢驗是哪些神經元把訊號傳給他們所感興趣的目標神經元。不過就像其他新技術,這個計畫也有不完善之處。有時能標記的連結數量相當少,大約10顆起始神經元才觀察到一條連結。


2015年,我和美國哥倫比亞大學神經科學家里爾登(Thomas Reardon)、生化學家傑塞爾(Thomas Jessell)和神經生物學家洛松齊(Attila Losonczy),應用了delta-G系統來研究引導運動神經元下達指令的神經迴路。我們發現脊髓或大腦中與運動神經元連結的神經元數量較少,意味我們看到的神經迴路可能還不完整。


而另一個問題是神經毒性:一旦病毒進入細胞,細胞會開始分解並在幾個星期後死亡。要是病毒本身會導致個別神經元改變行為,那麼就要很謹慎地解讀觀察結果以免誤判。後來我們向施內爾和美國湯瑪斯傑弗遜大學的微生物免疫學家伍伯里奇(Christoph Wirblich)尋求協助,他們在狂犬病毒生物學方面有開創性的研究。他們立刻發現我們的問題出在實驗中使用的病毒株,這種病毒株最初用於製造狂犬病疫苗。


疫苗含有人為選定的特殊病毒株,可以迅速繁殖,好讓眾多病毒顆粒能從受感染的細胞中爆發,希望及早啟動免疫系統。這個忠告提醒我們後續改進研究工具的方向。因為研究對象是小鼠,所以與我們合作的病毒學家也建議改用經過多年微調、能感染小鼠神經元的病毒株。該病毒株的親本病毒來自野外,在實驗室中反覆感染小鼠腦部或是細胞株而「固定」起來。


因此,它已演變成專門感染小鼠神經系統的高手。我們利用這種具有小鼠專一性的病毒株發展出神經元追蹤機制,發現能標記到比之前更多的神經元連結。此外,身為躲避小鼠免疫系統的高手,這種病毒只會製造相對少量的病毒蛋白質。因此,它帶給宿主細胞內各種物質的影響比較小,讓神經元保持相對健康狀態。


我們進一步改變追蹤系統,採用離子通道視紫質(ChR)這種光敏感蛋白質取代狂犬病毒中的螢光蛋白。ChR最初在綠藻中發現,當ChR被藍光活化後會戲劇性打開一條通道,讓攜帶正電荷的離子流進目標神經元,促使它發出電訊號。(不過受感染的細胞還是會發光,因為我們使用與螢光蛋白融合的ChR版本。)使用這種微調過的狂犬病毒系統,我們可以在病毒感染神經元後一個月內,觀察小鼠特定行為過程,也可活化或關閉這些訊號來觀察相關神經迴路的電生理訊號。這讓我們有足夠時間進行許多測試,逐步了解特定神經迴路產生動作的過程。


繪製神經迴路圖


神經科學家採用不同版本的delta-G狂犬病毒系統,已經探測神經系統中的迴路,更加了解這些迴路如何觸發動物的感知和行為。以視覺系統為例,眼睛看到光線時,視網膜後側的視網膜神經節細胞會把訊號傳給大腦。科學家過去認定這些訊息會傳到大腦中間位置,最終進入皮質處理。瑞士曼斯徹生醫研究所的研究員羅斯卡(Botond Roska)所領導的研究團隊,採用狂犬病毒系統追蹤視網膜神經節細胞的訊號至外側膝狀核(LGN),傳統觀點認為LGN這個腦區是訊號前進皮質的中繼站。


研究人員發現LGN含有三種不同類型的神經元,每種神經元處理視覺訊息的方式都不同。實際上,LGN裡不到1/3的神經元扮演中繼站角色,這些證據說明訊息可能從視網膜直接連通皮質;另外1/3的神經元會接收到來自單眼的不同訊號組合;剩下約40%的神經元則接收來自雙眼的訊號。儘管LGN處於視覺迴路的前端,但其中大多數神經元會整合不同來源的訊號。這項發現可望闡明大腦如何解讀眼睛傳進來的訊息。


我和美國哥倫比亞大學的同事研究的是側前庭核(LVN)的神經元,這腦區的功能是避免人類跌倒。想像一下,你站在一輛移動的火車上,突然火車停下來了。在你有時間思考之前,你的腳會自行移動來保持平衡、腿部肌肉會緊繃,也許你會抓住靠近自己的手把。在類似的情況下,大腦如何迅速活化正確的肌肉群呢?


我們發現小鼠的LVN包含兩種不同類型的神經元,每一種神經元各自與神經系統中不同的下游神經元相連。在大腦偵測到身體不平衡後,有一類神經元很快活化,這些神經元的作用是延伸肢體的活動範圍以擴大支撐基礎。之後第二類LVN神經元也會活化,這些神經元協助加強並穩定關節,幫助身體回復到原來姿勢。


我們讓LVN與光纖纜線相連,只需開啟藍光就能活化這些神經元。當藍光亮起,實驗小鼠開始調整四肢的位置,就像要預防自己跌倒,但牠們並沒有失去平衡。哈佛大學的分子細胞生物學家內田直茂(Nao Uchida)領導的研究團隊,探究了第三個重要問題:釋出多巴胺的神經元有什麼功能?


黑質緻密部(SNc)和腹側被蓋區(VTA)這兩個腦區的神經元分泌多巴胺,科學家認為這些神經元和報償系統有關。當受試動物得到獎勵,或者感官受到刺激而預期即將獲得獎勵時,會變得非常興奮(想像你正拆開一根棒棒糖的包裝紙,過程中包裝紙所發出的沙沙聲。)想了解這些神經元接收的訊號類型,科學家得先知道它們如何連結到腦部迴路。內田直茂的研究團隊運用delta-G系統,發現SNc的多巴胺神經元接收的是與刺激和報償相關的訊息:這種糖果包裝發出的聲音是否能讓我得到巧克力?而VTA接收的是有關報償品質的訊息:這種糖果好吃嗎?


事實上,帕金森氏症患者的主要病理症狀是SNc多巴胺神經元逐漸退化。內田直茂和同事還發現,把訊號傳給SNc多巴胺神經元的部位主要來自參與動作控制的視丘下核。深部腦刺激術透過植入電極來活化視丘下核,通常可有效緩解帕金森氏症的症狀。研究人員認為他們找到的訊號輸入路徑可解釋深部腦刺激術為何能發揮作用,由於這項研究也找到其他把訊號傳給SNc的腦區,因此他們推測刺激其他腦區也可能有益於帕金森氏症患者。


因此,結合自然演化與特定基因改造技術,提供神經科學家非凡強大的工具。相關技術還有很大的改善空間,例如是否能設計出朝向下游移動的病毒,標記接收訊號的神經元?我們能否只標記神經元之間真正有作用的連結,同時發現涉及不同行為的神經迴路?狂犬病毒操縱並恐嚇人類已經數千年,是時候換我們來操縱病毒、服務人類了。