物理

飛秒級分子電影Action

科學家結合雷射與晶體的新技術,記錄藥物反應或光合作用的關鍵數飛秒,協助我們了解分子如何進行交互作用。

撰文/弗洛姆(Petra Fromme)、史賓斯(John C. H. Spence)
翻譯/甘錫安

物理

飛秒級分子電影Action

科學家結合雷射與晶體的新技術,記錄藥物反應或光合作用的關鍵數飛秒,協助我們了解分子如何進行交互作用。

撰文/弗洛姆(Petra Fromme)、史賓斯(John C. H. Spence)
翻譯/甘錫安


美國加州帕洛亞托附近山丘的地下深處,科學家在實驗室中匆匆來去,為一連串「爆破」做最後的準備。他們計畫爆破蛋白質晶體,揭露自然界中不為人知的奧秘:植物的光合作用如何把光轉換成化學能。一旦揭開了這個奧秘,人類將朝用之不竭的潔淨能源邁進一步。


2009年12月,史丹佛直線加速器中心(SLAC)國家加速器實驗室裡,一群睡眠不足的研究人員和學生已經持續工作了好幾天,準備運用全世界能量最強的X射線雷射進行這項實驗;這座直線型加速器同調光源(LCLS)可把電子加速到接近光速。一組人埋首調整噴頭,把蛋白質晶體噴入X射線束;另一組則在噴頭中裝入第一光系統(photosystem I)晶體,這種蛋白質複合體是植物進行光合作用的關鍵。


在三公里長的加速器隧道末端,晶體開始噴入高強度雷射。但這些晶體爆開前,已經由一項新開發的技術拍下其身影。現在這項技術將大幅改變我們對最小尺度生物學的理解,因為目前我們可以把數飛秒(1飛秒是10-15秒)的一連串快速影像拼接成影片。


物理學家費曼(Richard Feynman)說過:「所有生物活動都可以想成原子在搖動和擺動。」但以往我們無法直接看見生物內部原子和分子的搖動或擺動。序列飛秒晶體學(serial femtosecond crystallography, SFX)技術可讓我們觀察分子的迅疾變化,以判斷藥物如何影響受感染的細胞,並且窺看化學反應如何把能量轉換成不同的型式。


世界各地的研究團隊已經開始運用SFX,深入探查實驗藥物如何調節血壓,以開發更有效的降血壓藥物。SFX也揭露了非洲昏睡症破壞紅血球酵素結構的過程,這種由寄生蟲導致的疾病可能致人於死。再者,SFX還讓人類首度目睹光合作用的初期階段,觀察水如何分解成氫和氧。


2009年在那間地下實驗室中,X射線脈衝開始摧毀我們精心製作的晶體,關鍵時刻到了。許多科學家說SFX不可能成功,拒絕核准經費資助。但是還記得當我們看見美麗的X射線散射影像在電腦螢幕顯現,實驗室裡歡聲雷動、不絕於耳,證明X射線科學的新領域已然誕生。


捕捉飛秒瞬間


SFX問世前,科學家在探測特定化學結構方面已經獲得驚人的進展,但仍然難以實際觀察到最精細複雜的生物結構。舉例來說,已過世的1999年諾貝爾化學獎得主齊威爾(Ahmed H. Zewail),於1980年代發明一套方法,藉由超快可見光雷射脈衝觀察化學反應中的原子運動。然而這種光的波長太長,難以分辨蛋白質結構最微小的細節。近年來,顯微技術大幅進展,已可呈現解析度與原子相當的蛋白質和病毒影像,但拍攝速度不夠快,無法捕捉到光合作用這類迅疾的反應。


我們決定使用X射線,因為它的高速拍攝和解析度可記錄進行中的生物反應。我們的研究關鍵在於,如何在X射線摧毀分子的前一刻,藉由X射線捕捉分子影像。科學家以往進行這類研究,必須辛苦製作蛋白質和其他分子的大型晶體,以得知晶體內部原子的位置;接著運用X射線照射晶體,記錄X射線的散射或繞射圖形。分子在晶體內部有固定的排列方式,因此科學家可以透過X射線的散射方式,推測出原子的位置和種類。這種方法稱為X射線晶體學(x-ray crystallography),我們開發的SFX也是運用相同的原理來觀察原子在結構中的位置,但拍攝速度快上許多。


然而,X射線最後摧毀了我們想觀察的分子。一般大多認為,X射線雷射是把高能量X射線集中成高強度光束,因此狀況只會更糟。單單高強度雷射就能把鋼鐵燒出一個洞,許多人可能認為脆弱的生物分子一定無法承受。我們必須在X射線傷害晶體前的幾飛秒內搶先捕捉到影像。為了說明得更清楚,一飛秒和一秒之間的差異相當於一秒和3200萬年。


SFX技術的關鍵在於,從分子受X射線雷射脈衝照射到電子因X射線能量而脫離原子的片刻。電子脫離後,帶正電的原子核將互相推斥,分子膨脹進而爆裂。


整個過程的運作機制是:首先我們使分子交互作用,形成微小的晶體。接著利用極短暫的高強度X射線束脈衝照射晶體,在光束能量破壞分子之前,讓一部份X射線剛好足以從晶體散射。最後,以一具偵測器捕捉散射的X射線,所記錄的圖形會呈現蛋白質中原子的位置和種類。透過一連串蛋白質晶體以不同角度噴入X射線束的影像,我們就可重建蛋白質的立體結構。然後,匯整化學反應中不同時間點的影像,並仿照電影膠片把一張張影像依序排列。


製作分子影片的第一步於2000年跨出。當時任職於瑞典烏普沙拉大學的生物物理學家哈吉杜(Janos Hajdu)和諾伊澤(Richard Neutze)計算出,分子受X射線照射後大約在10飛秒後爆開。因此科學家必須在更短時間內拍下影像。2006年,現任職於德國電子同步加速器(DESY)的查普曼(Henry Chapman)等人利用「繞射後破壞」的方法,成功取得蝕刻在氮化矽薄膜上的兩個人形和太陽圖案的低解析度影像。


但這種方法適用於脆弱的生物分子嗎?我們提議嘗試時,科學界大多抱持懷疑態度,我們最初的10次補助提案都被打了回票。懷疑者表示X射線雷射脈衝的時間不夠短;或是蛋白質晶體太小,產生的訊號無法偵測;或是我們不可能在X射線脈衝照射到晶體時辨識出晶體的方位,仍需要其他資訊才能判定其結構。


但我們認為,查普曼曾經證明其他分子的影像可以拍攝下來,那麼生物分子也不該例外。本文作者弗洛姆和團隊成員藉由最困難的一項試驗:第一光系統,來考驗SFX的能耐。第一光系統由36種蛋白質和300多種會吸收光的綠色和橙色色素構成,是至今利用X射線分析過的蛋白質中最複雜的一種。


弗洛姆非常熟悉第一光系統,已投入將其結晶化的研究多年,並借助其他方法探究其結構。我們也認為生物分子複合體龐大的尺寸應該是優點,因為即使只有少數幾個繞射圖形,我們就能取得可辨識出第一光系統的低解析度影像。其實2009年在那間地下實驗室中,我們拍到的就是這樣的影像。


小晶體有大美


要拍攝這類影像,我們首先必須製作第一光系統的晶體。在一般結晶學中,科學家需要培養出大型晶體,以產生足夠的X射線繞射、呈現蛋白質的結構。但要長出整齊劃一的大型蛋白質晶體,動輒數年。有些蛋白質已經確定不可能製作成這樣的晶體,第一光系統即是一例。


不過SFX使用的是奈米尺寸晶體,在實驗室中比較容易培養,但使用奈米晶體會帶來新的挑戰。我們不僅必須從這麼細小的晶體取得足夠清晰的訊號,還必須面對一些基本物理挑戰:我們該如何偵測小到連顯微鏡都無法觀察的奈米晶體?更不用說要找出它在X射線前方的位置,而且必須以每秒120次持續進行實驗。


首先,我們必須發展出新的方法來觀察奈米晶體。我們採用的一項技術稱為二階非線性掌性晶體成像(SONICC)。憑藉晶體把兩個超快紅外脈衝轉換成一個綠色光子,像夜晚的螢火蟲一樣照亮奈米晶體,協助我們偵測。


另一項技術運用一致的步調,把晶體送入X射線雷射脈衝。本文作者史賓斯和亞利桑那州立大學的物理學家維爾斯托(Uwe Weierstall)及道克(Bruce Doak)設計了一種裝置,功能類似噴墨印表機,可噴出一道含有奈米晶體的溶液,與X射線束交叉。這款噴頭的精準度極高,能把奈米晶體一個接一個送入。


為了避免噴嘴堵塞,導致奈米晶體束中斷,維爾斯托設計的噴嘴口徑必須夠大,但又能噴出極細的晶體束。他用一束氦氣圍繞噴嘴,使晶體束集中在直徑比人類頭髮還小的區域內,但其實噴嘴口徑比晶體束寬度大了10倍以上。


機械裝置一切就緒後,我們又碰到了一個問題:該如何處理龐大的資料量?一次實驗可能產生資料多達100兆位元組(TB),足以裝滿25部最高階桌上型電腦硬碟。此外,建立3D影像時,我們必須從數萬張影像中尋找並合併每個晶體的正確方位。因此我們和查普曼團隊的兩位成員基里恩(Richard Kirian)以及懷特(Thomas White)合作開發專用軟體。有了這款新軟體,我們就能把如海嘯般湧進的龐大資料量轉換成精確的分子3D影像。


我們一步步改良這項技術。到了2014年,我們首度即時觀察到光合作用兩大主角間的電子轉移:其一是主要的陽光吸收對象第一光系統,以及鐵氧化還原蛋白(ferredoxin)。


光照射到第一光系統時,電子脫離,被鐵氧化還原蛋白帶走,作用於二氧化碳轉換成生物分子。鐵氧化還原蛋白離開時,蛋白質晶體快速溶解,這種反應狀況難以偵測,只有超快的SFX能夠觀察到這種迅疾變化。


這項研究接下來的挑戰,是弗洛姆生化研究生涯的重要工作:解析植物如何只用陽光和地球上含量豐富的金屬,就能把水分解成氫和氧。植物分解水的方法可產生價格低廉又環保的氫,供給汽車和發電廠當成燃料;這是再生能源經濟長年以來的夢想。


我們已取得水分解過程的第一批低解析度影像,並初步看見過程中第二光系統的重要結構變化。不久之前,日本岡山大學沈建仁(Jian-Ren Shen)的研究團隊運用SFX記錄此過程,並拍攝到細節更豐富的影像。後續,我們將嘗試製作高解析度影片,呈現此過程所有階段的原子尺度細節,並揭開光合作用的奧秘。


量身訂做藥品


科學家已經開始借助SFX製作影片,這些影片不僅可在未來促成重大突破,現在就已帶來更有效的新型藥物。我們研究第二型血管收縮素(angiotensin II)受體阻斷劑(ARB)時發現了這項潛力,這類藥物可干擾會使血管收縮的第二型血管收縮素的細胞受體。因而ARB可用於降低血壓,高血壓是美國人中風和心臟衰竭主因。第一代的這類藥物雖然相當有效,但藥物與目標受體的結合程度相當差,病患必須服用很高的劑量,副作用也因此加劇。除了引發頭痛、暈眩,偶爾還會導致臉部和喉嚨腫脹等更嚴重的問題。


我們的研究找出結合程度不佳的原因:這種藥物與目標受體的結構兩者並不吻合,所以有許多分子結合不住。更精確的受體結構有助於開發新型ARB。事實上,目前正在評估新型ARB藥物ZD7155的效果。


這些進展也可改良其他許多藥物。第二型血管收縮素受體是一種G蛋白耦合受體(G-protein-coupled receptor),這類細胞受體的數量更多,而且極為重要。這些細胞表面分子讓細胞感應環境並產生反應。杜克大學的化學家萊夫科維茲(Robert Lefkowitz)與史丹佛大學的化學家克比爾卡(Brian Kobilka)首先發現這種受體的結構與運動,因此獲頒2012年諾貝爾化學獎。G蛋白耦合受體在細胞存活和生長中扮演的角色十分重要,因此成為新藥物的重要標靶。如果能觀察它們的結構變化,將可協助藥理學家設計出與處於運動狀態下這類受體完全吻合的藥物,降低副作用。


南加州大學的契爾佐夫(Vadim Cherezov)正在進行第二型血管收縮素實驗,他表示:「我們已經證明,關於受體與藥物如何互相吻合的最佳解釋,以往的分子模型中許多重要細節是錯誤的。」


舉例來說,我們已藉由SFX發現,在室溫與以往研究晶體採用的超低溫下,G蛋白耦合受體的結構不大相同,也就是說,針對處於冰凍狀態下的受體設計出的藥物,在溫暖的人體中無法完全吻合(有時藥物的目標範圍太廣,非洲昏睡症的藥物就有這樣的問題。我們的影片也證明,這類藥物與病原寄生蟲的交互作用,和藥物與人類蛋白質的交互作用類似。我們拍攝出更精細的影像,讓化學家可以設計出只影響寄生蟲蛋白質但不影響人類蛋白質的藥物)。


揭露視覺奧秘


我們很高興得知,其他研究人員也採用我們的SFX來解決各種問題。舉例來說,威斯康辛大學普萊維爾分校的施密特(Marius Schmidt)等人最近就以分子影片輔助解釋人類眼睛如何看見物體。我們通常認為細菌沒有視覺,但它們其實具有光反應蛋白,此蛋白後來演變成人類視覺系統的光反應蛋白。這個研究團隊拍攝了比以往更高速的影像,把過程極快的事件製作成超慢動作影片,藉此觀察細菌細胞內的蛋白質如何感應光並產生反應。


這個團隊採用SFX拍攝蛋白質晶體與光反應過程的影像,時間間隔短於兆分之一秒。具體來說,注入蛋白質中的染料分子受到光照後轉變成黃色,這個團隊測得此時蛋白質中原子的位置。這是科學家首次在黃色染料分子吸收光後、發生反應前捕捉到其結構的影像,這種狀態是細菌和植物等所有生物感應光的基礎,也是人類視覺的源頭。


了解這種蛋白質對光的反應,不僅有助於解析視覺如何形成,也讓我們首度以超快的時間尺度觀察生物反應如何進行。施密特表示:「這項技術讓我們更進一步了解所有生物的化學反應。」


我們相信,SFX不僅是蛋白質晶體學未來的希望,也是理解自然界的重要工具。說不定在10年內,所有已知的蛋白質結構將有一半不再以教科書中的靜態影像呈現,而是躍上螢幕、以3D影片呈現在人們眼前。


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