科學人剪影

為生命上色-諾貝爾化學獎得主──錢永健

螢光蛋白已成為生命科學研究的重要工具,錢永健當初如何從一名幾乎找不到工作的生理學博士,逐步建立這項重要工具,並因此獲得2008年諾貝爾化學獎?

撰文/李名揚

科學人剪影

為生命上色-諾貝爾化學獎得主──錢永健

螢光蛋白已成為生命科學研究的重要工具,錢永健當初如何從一名幾乎找不到工作的生理學博士,逐步建立這項重要工具,並因此獲得2008年諾貝爾化學獎?

撰文/李名揚


綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的發現與使用,讓研究人員得以觀察活細胞內的各種作用,對生命科學的發展具有革命性的貢獻,三位研究綠色螢光蛋白的學者下村脩、喬非(Martin Chalfie)和錢永健因此獲得2008年諾貝爾化學獎。其中最受國人矚目的是美籍華裔的加州大學聖地牙哥分校教授錢永健,他將綠色螢光蛋白中的發色團改造後,創造出不同顏色的螢光蛋白,大幅提高螢光蛋白的應用性。他在2009年底應邀來台演講,是台灣生命科學界的盛事。

綠色螢光蛋白最早是由日裔化學家下村脩於1961年從維多利亞管水母(Aequorea victoria)中發現的,它最大的特徵在於不需要其他分子的協助,只要照射藍光或紫外光,即會發出綠色螢光。下村脩沒有意識到綠色螢光蛋白的應用前景,他從普林斯頓大學轉到伍茲赫爾海洋研究所後,那裡的同事普萊雪(Douglas Prasher)很想開發生物示蹤分子,對綠色螢光蛋白充滿興趣,就投入研究,並於1992年找出綠色螢光蛋白的基因。但是普萊雪並未因此申請到美國國家科學基金會的研究經費,於是離開了學術界,不過後來美國哥倫比亞大學教授喬非和錢永健向他索取綠色螢光蛋白的基因時,他都慷慨贈與。

喬非研究的是線蟲(Caenorhabditis elegans)。他將GFP基因植入線蟲的觸覺受器神經元中,使神經元發出綠色螢光,而線蟲並不會受到任何不良影響。這代表科學家只要透過遺傳工程技術,將GFP基因和生物的目標基因連接,就可以觀測目標基因在生物體內的表現情形;若將綠色螢光蛋白接在特定蛋白質產物上,則可觀測該蛋白質在細胞中的分佈。


從綠色到五彩繽紛

錢永健在發展綠色螢光蛋白之前,研究的是螢光探針,他開發出可以有效偵測生物體內鈣離子濃度的感應型螢光探針,又發展出用螢光分子偵測環單磷酸腺?(cAMP)的技術,都是很了不起的成就。但他深知後者的偵測原理在使用上有其極限,因為操作方法非常複雜,不容易應用到蛋白質的偵測;而且要將螢光分子注入細胞,需要非常精細的操作,細胞也必須夠強壯,才能承受這一針,這都大幅限制了其應用範圍。

要解決這個問題,用螢光蛋白的基因來取代螢光分子是適當的解決之道,因為基因可以植入細胞的基因組中,然後在細胞內合成螢光蛋白。這時錢永健想起了下村脩的綠色螢光蛋白,他還記得那是1992年4月或5月的某一天,他透過學術網路進入美國國家醫藥圖書館的文獻資料庫,打算搜尋有關綠色螢光蛋白的資料,卻意外發現普萊雪剛剛發表了選殖出GFP基因的論文,他馬上衝到圖書館去印下這篇論文,並向普萊雪索取GFP基因。

雖然普萊雪答應得很乾脆,錢永健卻沒有馬上去拿GFP基因,原因是他的實驗團隊中沒有人受過分子遺傳學的訓練。一直到9月,錢永健終於等到熟悉相關技術、來自瑞士的博士後研究員海姆(Roger Heim)加入他的實驗室,雖然海姆並不想繼續從事分子遺傳相關的工作,而想學習螢光探針的技術,不過錢永健終於說服海姆花一些時間來研究GFP基因。

於是錢永健向普萊雪取來GFP基因,此時普萊雪告訴他,喬非也拿了GFP基因。之後沒多久,喬非就在酵母菌中表現出GFP,而海姆也全心投入這項工作,並順利讓酵母菌發出綠色螢光。

接著錢永健開始發展不同顏色的螢光蛋白。他首先解析出綠色螢光蛋白是由238個胺基酸組成,其中關鍵的發色團是由第65、66、67個胺基酸結合而成,並解出這種結構如何產生螢光。接著他要海姆將第66個胺基酸從酪胺酸改造成色胺酸,可是發色團反而被破壞,於是海姆決定採隨機突變的方式,一個一個鑑定,很快就發現若將第66個胺基酸換成組胺酸,就可得到藍色螢光。之後他們又陸續得到黃色、青綠色等螢光。

可是他們一直做不出紅色螢光,而紅光波長較長,對組織穿透力較強,有特殊的應用價值。後來兩名俄羅斯科學家馬茲(Mikhail Matz)和路基雅諾夫(Sergei Lukyanov)從珊瑚中找到紅色螢光蛋白DsRED,它是由四條胺基酸鏈組成的大型蛋白質,並不適合用於生物螢光標定;但錢永健卻想出辦法,將DsRED改造成只有一條胺基酸鏈的簡單蛋白質,而成為生物螢光標定的好工具。

童心未泯的錢永健還依照顏色,將不同顏色的螢光蛋白取名「香蕉」、「檸檬」、「小紅莓」等。有了不同顏色的螢光蛋白,科學家就可用來標示出不同的基因或蛋白質,而更容易研究其中的關聯性,或是確認基因或蛋白質表現的時間和位置。例如腦中的神經網絡錯綜糾結在一起,非常複雜,難以辨認,但只要讓不同神經細胞發出不同顏色的螢光,就可加以分辨。現在全世界科學家所使用的螢光蛋白,大部份都是錢永健改良的,但他總是很謙虛地表示,他只是將一本晦澀的小說改編成一部通俗電影而已。


優游螢光世界

錢永健從小就喜歡化學實驗造成的多變顏色,因為身體不好,平常也只能待在家裡做實驗。他在高中時就嶄露頭角,以硫氰酸鹽溶解金屬的實驗,獲得全美極負盛名的「西屋科學天才獎」,接著進入哈佛大學化學系就讀。可是他並不喜歡學校開設的化學課程,因此畢業後前往英國劍橋大學留學,轉念神經科學。

這時發生了一件糗事:劍橋為錢永健安排的指導教授是艾德瑞安(Richard Adrian),他沒聽過艾德瑞安,便向在耶魯大學擔任電生理學教授的二哥錢永樂詢問,二哥告訴他艾德瑞安是全英國最好的肌肉電生理學家,錢永健的第一個反應卻是「肌肉研究已經過時了,我想研究的是腦!」等錢永健到了劍橋,見到艾德瑞安,艾德瑞安竟然問他:「你真的認為肌肉研究已經過時了嗎?」原來二哥竟拿這句話去取笑艾德瑞安。

不過錢永健仍然跟著艾德瑞安做研究,只是他不喜歡研究中樞神經電生理學的傳統方法。傳統方法是將很多微小的電極插進麻醉動物的腦中,然後記錄神經細胞受到刺激時的活動情形,他認為這種方法就像在冰上釣魚:垂下魚線、魚餌後,就只能等待魚兒上鉤。可是實際上腦中有數不清的神經細胞同時運作,他希望看到很多腦神經同時發出信號並且互相傳遞,而這可以靠螢光染色辦到;但當時螢光染色的信號只有萬分之一的變化,微弱到難以偵測,於是錢永健決定「發展螢光探針」就是他要走的路。

螢光探針分為標示型和感應型,都是一端為螢光分子,另一端為跟偵測對象結合的辨識分子。標示型探針在跟偵測對象結合後,螢光團不會改變,因此比較容易製作,缺點是必須要做實驗確認探針確實跟偵測對象結合了;感應型探針則會在跟偵測對象結合後,改變螢光團的光物理性質,使螢光的波長或強度有所變化,這通常涉及分子的化學設計。

錢永健最早研究的是可以偵測鈉離子通道活性的感應型螢光探針,這必須使用有機合成的方式,偏偏有機合成正是他在大學時很討厭的一門課。幸好他找到另一名專精此道的年輕教授指導他,而且他也很驚訝地發現,當他為了自己的研究目的而進行有機合成時,竟然可以樂在其中。

偵測鈉離子的螢光探針必須能跟鈉離子專一性結合,並在結合後改變螢光,錢永健在這方面的研究並沒有成功。不過此時有一項發現轟動了學術界:原本用於測量核廢料中重金屬濃度的偶氮砷三號(arsenazo Ⅲ)也可以測量槍烏賊神經細胞軸突的鈣離子濃度,這項新發現吸引錢永健轉而研究鈣離子螢光探針。

當時已有許多人在研究偵測鈣離子濃度的方式,但這些方式都不能在細胞內使用,因為在細胞內,跟鈣同一族的鎂離子濃度遠高於鈣離子濃度,而這些偵測分子跟這兩者都會結合,無法分辨。

錢永健想到有一種無色的螯合劑EGTA可跟鈣離子專一性結合,但從沒有人想過用EGTA來做螢光分子。他試著解析EGTA的分子結構,覺得有機會改造成螢光分子,但這是一種全新的嘗試,他怕被指導教授阻止,因此只能偷偷進行,幾個星期之後,他成功合成出可和鈣離子專一性結合的螢光分子BAPTA。一直到多年以後,偵測鈣離子最好的分子仍然是依據BAPTA改良而成的螢光分子。

雖然在博士班時期就獲得了相當傑出的成就,錢永健尋找教職的過程卻極不順利,不論在英、美都是如此,有些學校甚至連面試的機會都不給,因為「生物系視我為化學家,而化學系視我為生物學家。」回想起這段經歷,錢永健感慨地說,那是他生命中非常困頓的時期,很沒安全感;幸好在舊識的加州大學柏克萊分校教授幫助下,他獲得了面試的機會,並順利進入任職。

錢永健在柏克萊繼續研究各種可和金屬離子專一性結合的螢光分子,並獲得豐富的成果,但是他不想從此陷入無生物的領域,希望研究複雜生物分子之間的訊息傳遞,於是他在1989年轉到加州大學聖地牙哥分校,研究人體內很重要的訊息傳遞分子cAMP的螢光偵測方式。

錢永健是利用「螢光共振能量轉移」(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的技巧來偵測cAMP。FRET是1960年代發展出來的螢光團應用技術,而維多利亞管水母的發光則是人類第一次在生物中發現這種現象。維多利亞管水母的綠色螢光蛋白必須照射藍光或紫外光才會發出綠色螢光,但其生長在陽光照不到的海裡,會發出綠色螢光是因為體內的水母發光蛋白(aequorin)和鈣離子並存時發出藍光,藍光再激發綠色螢光蛋白發出綠光。在FRET效應中,水母發光蛋白是給予者,綠色螢光蛋白是接受者,只有兩者距離夠近時,接受者才能吸收到給予者發出的螢光,而發出另一種顏色的螢光。

錢永健將兩種螢光分子分別接到cAMP依賴性蛋白激?(cAMP-dependent protein kinase, PKA)的兩個次單元上,分別擔任給予者和接受者。由於該酵素與cAMP的結合會影響兩個次單元的接合與相對距離,因而會呈現不同顏色的螢光 (見下圖)。


科學研究不分種族

在螢光探針及FRET的研究都已獲得相當成果後,錢永健在40歲那年才投入綠色螢光蛋白的研究,並因此獲得諾貝爾化學獎。當他得獎的消息傳出,兩岸華人媒體都因他的華裔身分而大肆宣揚,其實錢永健並不認為在科學的領域中需要強調自己的族裔。

錢永健出生於美國,從小就不喜歡學中文,所以不太會講,也不喜歡吃中國菜,可說是道地的美國人。但黃皮膚仍曾為他帶來困擾,他還記得當初父親要買房子時,建設公司不肯賣,說其他客人不願意買中國家庭旁邊的房子,後來鬧上州政府,州政府才下令不得種族歧視。不過讓錢永健非常得意的是,後來他獲得西屋科學天才獎,建設公司卻使用他的照片做為售屋宣傳。

去年底來台演講時,錢永健強調,所有偉大的文明,都是因為能夠跳開國籍的情結、對膚色的歧視、宗教的分歧,憑著兼容並蓄的文化,才能成為世界的領導者,中國最盛時的唐朝就是很好的例子。事實上,他自己也正努力這麼做,實驗室成員都來自世界各地。

在學術的世界裡,除了努力之外,有時候也需要一點運氣。錢永健1996年將一篇研究綠色螢光蛋白晶體結構的論文投稿到《科學》,當時國際上有好幾個團隊在這個領域競爭,其他人都是解析水母細胞內的綠色螢光蛋白結構,只有錢永健研究的不一樣,是改造過發色團胺基酸、發光比較穩定的綠色螢光蛋白,結果有一名審查委員質疑這樣做的意義,另一名認為研究重點應該是綠色螢光蛋白在水母身上的功能,第三名委員則遲遲不給意見。此時,《自然‧生物化學》突然在網路上預告即將刊登一篇論文,是有人解出綠色螢光蛋白的結構,錢永健把這個訊息轉寄給《科學》,結果對方第二天就決定接受他的論文。


下一個目標:癌症醫療

在綠色螢光蛋白的研究已經取得豐碩成果後,錢永健又要挑戰下一個目標:把螢光蛋白用於癌症醫療,尤其是在他的父親因胰腺癌過世之後。

錢永健正在研究的,是把一種顏色的螢光蛋白(例如綠色)和細胞分裂時會表現的蛋白接在一起,把另一種顏色的螢光蛋白(例如紅色)和細胞停止分裂時會表現的蛋白接在一起。這會讓正常細胞有時呈現綠色、有時紅色,當細胞最終停止分裂,就會全部變成紅色。

而癌細胞的特徵之一是能夠持續分裂,不會終止。利用螢光蛋白染色之後,正在分裂者會呈現綠色、剛分裂完或處於暫時停止分裂狀態者呈現紅色、兩者混在一起就變成黃色,即可據此偵測癌細胞位置。

他還進一步設計可以協助癌症外科手術的螢光分子。外科手術時,醫師的困擾之一是單憑肉眼無法精確判斷癌細胞的位置,萬一沒有清除乾淨,癌症很容易復發;如果切到不應該切的神經,則會造成嚴重後遺症。若把螢光分子接上一段帶正電的胜?,進入人體後即會黏在帶負電的細胞表面,就會被細胞吞入、吸收,使細胞發出螢光,而達到標記的效果。然而大部份正常細胞與癌細胞表面都帶負電,這樣的標記方式毫無選擇性可言。

錢永健設計出一種U型結構的胜?鏈來克服這個問題。U的雙臂一臂是連接螢光分子的帶正電胜?,另一臂是一段帶負電的胜?,使整個結構成為電中性,不會被一般的細胞吸收;而將兩臂連接起來的胜?,會被癌細胞分泌的蛋白?分解,於是當這種U形胜?鏈接近癌細胞時,就會被切斷為二,其中具有正電、帶螢光團的一段會被癌細胞吸收,而使癌細胞在特定光源照射下發出螢光 (下圖)。


如此一來,手術時只要搭配成像設備,就能清楚看到發出螢光的癌細胞並精確切除;更可讓手術部位附近的神經發出不同螢光,以避免手術失誤。

錢永健有一個夢,他希望這套機制能和磁振造影儀(MRI)搭配,成為年度健康檢查的檢驗項目之一。做法是讓U形胜?鏈上面不接螢光分子,而改接可被MRI偵測到的分子,給予受檢者這種U形胜?鏈後,再用MRI進行全身掃描,找到U形胜?鏈聚集處,就是癌症病灶。這套構想的最大優點是只要體內有一點點癌細胞,就可以檢查出來。錢永健表示,對抗癌症是他終極的努力目標,他希望這套構想能在對抗癌症的路上發揮一些作用。


錢永健 小檔案

■1952年出生於美國紐約   
■1968年獲得西屋科學天才獎   
■1977年取得英國劍橋大學生理學博士學位   
■1981年進入美國加州大學柏克萊分校任教   
■1989年轉到美國加州大學聖地牙哥分校   
■2004年獲得沃爾夫醫學獎  
■2008年獲得諾貝爾化學獎


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